南美白对虾白斑综合症病毒的诊断和检测技术

　　宁波大学海洋与水产系　郑天伦王国良
　　
　　对虾白斑综合症病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV）也叫白斑综合症杆状病毒（WSBV）、系统外胚层和中胚层杆状病毒（SEMBV）、日本对虾杆状核病毒（RV-PJ）、对虾杆状DNA病毒（PRDV）、皮下及造血组织坏死杆状病毒（HHNBV）、中国对虾杆状病毒（PCBV）、淋巴样细胞核性杆状病毒（LNBV）（陈秀男等，1994；Wongteerasupaua等，1995；Inouye等，1994、1996；黄倢等，1995a；战文斌等，1995；陈细法等，1997），是全球对虾养殖业危害性最大的病毒之一。自1992年WSSV暴发性流行以来，造成了对虾养殖业的严重萎缩。鉴于WSSV尚未有有效的治疗方法，快速准确的病原分离检测技术已成为各国学者研究的焦点之一。

　　1、目视观察法
　　目视观察法是通过了解养殖过程中对虾急性和慢性死亡的情况，结合濒死对虾是否具有如头胸甲出现白斑、甲壳变软易剥离、虾体发红等白斑综合症的典型症状进行判断。这种方法可在现场紧急情况下且没有其他诊断方法可以使用时应用，以便采取抢收措施，减少损失。

　　2、传统组织学方法
　　即随机或非随机从虾池中取对虾或对虾粪便直接作湿标本检查,配合使用适当的染色技术，在光镜下进行快速检测，主要方法有T-E染色法和H-E染色法等。T-E染色法是黄倢等（1995b）首创的一种用于现场检测的方法，整个过程只需10min左右，具有快速、简单、方便等优点，但这种方法需要操作者具有较丰富的实践经验。值得注意的是，由于某些病毒存在于正常虾体中使对虾终生带毒而不发生病毒病，因此检测到病毒也不能就一定推断成对虾发生了病毒病。

　　3、电子显微技术
　　电镜观察法是最为直观的检测病毒性病原的方法，在电镜下可以直接观察到病毒的形态和大小。王斌等（1996）、石拓等（1998）分别报道了中国对虾一种病原病毒负染法电镜检测技术，认为负染法可作为对虾暴发性流行病的诊断方法；张建红等（1996）描述了一种电镜诊断快速制样的方法在对虾病害检测中的应用，该法大大缩短了常规制样法所需时间。其他学者也对对虾WSSV感染进行了电子显微镜观察（Nunan等，1998；Zhan等，1998）。但电镜观察法具有操作复杂、需要较严格的实验条件和较高超的实验技术、样品处理时间过长等缺点，不能用于生产实践中WSSV的快速诊断以及大量样品的检测，仅适用于实验室研究。

　　4、生化检验法
　　张吕平等（2000）研究发现，在患病虾血清中，Ca2+含量明显上升，患病虾为15.93mmol/L，健康虾为10.71mmol/L；而总蛋白（TP）、总磷（PB）及乳酸脱氢酶（LDH）则显著下降，三者含量依次为52.07g/L、0.34mmol/L及35.27IU/L，在健康虾个体血清中为66.29g/L、0.66mmol/L和82.36IU/L，可作为斑节对虾感染WSSV后出现白斑病的主要血清生化特征。可见，通过某些特定生化物质的检测，在一定程度上可以了解对虾被病毒感染与否。

　　5、免疫学方法
　　免疫学检测技术建立在抗原抗体反应的基础之上，检测策略灵活性很大，某些方法在快速鉴定应用方面有很大的优势。
　　酶联免疫吸附试验（ELISA）是根据酶免疫测定原理发展的一种固相免疫酶技术，由于具有灵敏度高、操作简便、重复性好等特点，是应用最广的免疫学技术。于佳等（1995）研制成功了WSSV单克隆抗体，黄倢等（1995c）则用单克隆抗体ELISA技术提前20-40天对虾池对虾的发病可能性作出预报。涂小林等（1996）报道了用纯化的病毒免疫兔子，得到了多克隆抗血清，建立了病毒的间接ELISA检测方法，可在六小时内完成对样品的检测，检测灵敏度达60ng水平。史承银等（1999）认为，以脱脂奶粉作封闭剂的快速间接ELISA方法具有大大缩短检测时间、提高检测灵敏度、降低或消除酶标板“边缘效应”、降低测试成本等优点，在对虾病毒检测的实验室研究和生产实践上都具有广泛的应用前景。汪岷等（2000）通过病毒纯化，免疫新西兰兔，获得多克隆抗血清，并对抗体进行纯化﹑酶标记，建立了双抗体夹心直接ELISA的检测方法。
　　Hameed等（1998）用硝化纤维素酶免疫印迹法（NC-EIB）对受WSSV感染的斑节对虾测得，在对虾淋巴、眼柄、鳃、头部软组织、腹肌和肝胰脏都存在有WSSV，表明该种病毒几乎存在于所有的组织和器官中。Zhan等（1999a，b）制备了WSSV的单克隆抗体，成功地在中国对虾体内检测到了WSSV。

　　6、细胞培养方法
　　细胞培养技术是病毒学研究的基础，也是用于病毒诊断的基本方法之一。由于病毒有严格寄生于活细胞的特性，因此，对虾细胞培养对于对虾病毒的研究尤其是对虾致病病毒的分离和鉴定有重要意义。然而到目前为止，还没有建立对虾的细胞系，所有的对虾细胞培养工作均处于原代培养阶段。苗宏志等（2000）为了考察WSSV能否用中国对虾淋巴器官的原代细胞来分离和繁殖，进行了人工感染实验。结果证明，中国对虾的淋巴器官原代细胞完全可用来分离和体外繁殖对虾WSSV。

　　7、分子生物学方法
　　7.1核酸探针法（DNAprobe）
　　核酸探针是指被某种物质标记了的从而可以被探测到的核酸片段，它能特异性地与待检测的核酸结合、杂交。张岩等（1995）用Pub18构建了对虾WSSV的DNA重组质粒，提取后经斑点杂交及酶切分析，证实质粒中插入的片段为病毒DNA。刘萍等（1995）从纯化病毒中提取DNA，用限制性内切酶酶切并组装到质粒上建成WSSVDNA文库；从中筛选出三个重组质粒，分别用光敏生物素标记做成核酸探针，用于检测受WSSV感染的对虾，取得了满意的结果（刘萍等，1998）。他们研制的WSSV核酸探针试剂盒已经面世。邓敏等（2000）通过分离纯化WSSV粒子，抽提病毒DNA，用限制性内切酶EcoRI酶切后，制备为探针，进行Southern杂交、斑点杂交和原位杂交，其结果证明了克隆片段对WSSV特异，可作为检测WSSV的方法。徐洪涛等（2000）利用地高辛标记的WSSVDNA探针对病虾标本及纯化DNA进行斑点杂交检测，均呈阳性反应，而与正常对虾组织无杂交反应，从分子生物学角度证明了WSSV感染是造成我国养殖对虾连年暴发流行病的重要原因。雷质文等（2001）和Nunan等（1997）利用PCR法制备了基因探针，用于检测WSSV。Durand等（1996）也将基因探针作为检测WSSV的工具。而Chang等（1996）则用原位杂交法对斑节对虾的WSSV进行了检测。
　　7.2聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）
　　PCR技术的原理是根据已克隆的病毒DNA序列，设计PCR引物，利用该引物直接扩增样品中待检测病毒的DNA片段，从而通过电泳、染色把它显示出来。与传统诊断方法相比，它具有敏感性及特异性高、简单、快速等特点，已广泛应用于WSSV的检测（桃山和夫，1997；Kim等，1998；Kimura等，1996；Lo等，1996；Mushiake等，2000；Takahashi等，1996）。刘萍等（1999）采用PCR检测方法，对人工感染亲虾的胃、鳃、卵巢，以及卵和各期幼体进行跟踪检测，认为WSSV难以从卵直接向幼体进行传播。而战文斌等（2000）用PCR技术对不同生长时期的中国对虾进行了WSSV的检测，认为存在由亲虾传播给虾苗的感染途径。石拓等（2000）应用PCR技术分别对暴发性流行病发生前、流行中和发病后的对虾样品进行了检测，结果表明，PCR可以快速、灵敏而准确的检测WSSV，对病毒病的早期诊断、防治和高健康对虾品种的选育具有指导意义。目前，国内外均已开发出商品化的WSSV的PCR检测试剂盒。
　　一些学者还对PCR技术做了不同的改进，使检测结果更快速、准确。吕玲等（2000）用改进的煮沸法提取病毒DNA，再进行PCR扩增，可节省检测时间（仅需4h），且敏感性更高，重复性更好。Tang等（2000）采用竞争性PCR法，定量对检测了受WSSV感染的对虾血淋巴和头胸部组织样品中WSSV的DNA。Lo等（1997）和谢数涛等（2001）分别采用套式PCR对WSSV进行了检测，结果显示其灵敏度大约为一步PCR的104倍。夏春等（1999）对WSSV的基因进行了PCR扩增和RFLP分析，建立了PCR法检测WSSV的方法。
　　7.3随机扩增多态性DNA技术（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD）
　　RAPD技术是建立在PCR技术基础上的新的分子标记技术。其基本原理是采用随机合成的较短的单个随机引物，对病毒或其他生物基因DNA进行PCR扩增。将PCR产物进行凝胶电泳形成病毒核酸指纹图谱，不仅可以检测同种病毒，还可以进行不同种病毒间DNA序列的同源性比较。孔杰等（1997）已将这一技术应用于对虾病毒的鉴别。研究显示，1995年中国对虾的杆状病毒与1994年相同，证实这两年度引起中国对虾暴发性流行病的病原属同一种病毒。

　　8、小结
　　综上所述，对虾WSSV的诊断研究取得了一定进展。从最初主要依靠组织病理学和透射电镜观察来诊断和检测WSSV，到现在大量采用PCR技术、DNA杂交和免疫学方法，灵敏度、特异性和重复性都有了很大的提高，而且检测结果更加快速、准确。但以上方法都需要获得纯净的WSSV，而随时获取大量纯净病毒的方式是细胞培养，因此，迫切需要在较短的时间内建立起可以大量繁殖WSSV的适宜细胞株。另外，将各种检测方法结合使用也可进一步提高灵敏度，如制备DNA探针时，可利用PCR技术使探针量增加（雷质文等，2001；Nunan等，1997）；DNA杂交也可与ELISA结合使用，即采用酶标记探针的方法；PCR技术也可与DNA杂交结合使用，用DNA杂交检测PCR扩增的结果等。总之，随着方法的改进，WSSV的检测将更加直观、快速、简便、灵敏和特异。
　　
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